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漩渦振蕩器在土壤微生物中提取總DNA并純化應(yīng)用

更新時間:2013-09-25   點擊次數(shù):4298次

實驗概要


從土壤微生物中提取總DNA并純化,高質(zhì)量的DNA可用于后續(xù)文庫構(gòu)建。


主要試劑


TENP緩沖液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)

PBS緩沖液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)

DNA提取緩沖液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0)

蛋白酶K(25 mg/mL)

溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0)

20% SDS

氯仿

異戊醇

異丙醇

70%乙醇

RNAse 20 mg/mL

QIAXⅡ大片段凝膠回收試劑盒(Qiagen)


主要設(shè)備


50mL、1.5 mL離心管

搖床

高速離心機

水浴鍋

電泳槽

電泳儀

MixMax漩渦振蕩器


實驗材料


土壤樣品


實驗步驟


1. 總DNA提取:

    (1) 取2 g土樣,置于50mL滅菌的離心管中;

    (2) 加入10 mL TENP緩沖液(50 mmol/L Tris, 20 mmol/L EDTA, 100 mmol/L NaCl, 1% PVP, pH 10.0)懸浮土樣,200轉(zhuǎn)搖床振蕩10min充分混勻;

    (3) 10 000 r/min離心5 min,棄上清,重復洗滌多次至上清基本為無色;

    (4) 用5 mL PBS緩沖液(137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, pH 7.4)漂洗一次;

    (5) 沉淀加入13.5 mL DNA提取緩沖液(100 mmol/L Tris, 100 mmol/L EDTA, 100 mmol/L Na3PO4, 1.5 M NaCl, 1%CTAB, pH 8.0),混勻后加入100 μL蛋白酶K(25 mg/mL)和200 μL溶菌酶(50 mg/mL, pH 8. 0),37℃水浴30 min,每隔10 min顛倒混勻;

    (6) 加入2 mL 20% SDS,65℃水浴2 h,每隔20 min顛倒混勻;

    (7) 8 000 r/min室溫離心15 min,取上清,用等體積氯仿:異戊醇(24:1)抽提一次;

    (8) 水相中加入0.6倍體積的異丙醇,4℃沉淀一夜;

    (9) 11 000 r/min 4℃離心20 min收集DNA沉淀;

    (10) 70%乙醇漂洗兩次,干燥后用100 μL ddH2O(含RNAse 20 mg/mL)溶解,轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管。

2. 總DNA純化:

    (1) 配制0.8%瓊脂糖凝膠;

    (2) 每個上樣孔加入50 μL粗DNA,進行低電壓長時間電泳(4℃, 25 V, 8 h);

    (3) 電泳結(jié)束后,切下主帶所在的凝膠(膠的體積盡可能小);

QIAXⅡ大片段凝膠回收試劑盒(Qiagen)回收:加入3倍體積的Buffer QXⅠ及適量的QIAXⅡ(Glassmilk),55℃溫浴10 min,每隔2 min輕輕用手指彈起沉淀(回收大片段時不要渦旋),待凝膠*溶解,12 000 g離心1 min,棄上清;再加入500 μL Buffer QXⅠ洗滌沉淀1次以消除剩余凝膠;再用500 μL Buffer PE洗滌沉淀2次,將沉淀晾干,加入適當體積的ddH2O,離心后收集上清,瓊脂糖凝膠電泳確定回收效率。


 

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